نورترن بلاتینگ(Northern blotting)

این تکنیک توسط محققان دانشگاه استنفورد، جیمز الوین، دیوید کمپ و استارک در سال 1997 معرفی شد که در آن به دنبال RNA خواهیم بود.

مراحل Northern blotting:

1. استخراج: در این مرحله RNA را استخراج می کنیم. برای استخراج RNA نیاز است که غشای سلولی تخریب شود، برای تخریب و لیز سلول میتوان از ترکیباتی همچون گوانیدیوم ایزوتیوسیانات استفاده کرد. برای دستیابی به RNA خالص باید پروتئین ها و DNA توسط آنزیم ها(به عنوان مثال آنزیم پروتئیناز K جهت تخریب پروتئین) یا یکسری مواد دناتوره و حذف گردند.

• اگر به دنبال جداسازی نوع خاصی از RNA هستیم و کل RNA (Total RNA) را نمی خواهیم، به عنوان مثال به دنبال mRNA هستیم، می توانیم از روش ها که mRNA را براساس دم پلی A جداسازی می کند، بهره ببریم.

2. الکتروفورز
3. Blotting: انتقال RNA از روی ژل بر روی غشای نایلونی یا نیتروسلولزی
4. Baking: با قرار دادن غشا در معرض حرارت یا نور UV، قطعات تک رشته ای RNA را بر روی آن fix می کنیم. مرحله baking جهت عدم جداسازی RNA از روی غشا حین عمل شست و شو انجام می گیرد.
5. هیبریداسیون(Hybridization): در این مرحله پروب که می تواند رادیولیبل یا فلورسنت لیبل باشد، به RNA هدف متصل شده و از فیلم حاصل از اشعه X برای مشاهده باندها استفاده می شود.

Procedure:

1. RNA isolation
2. Separation of RNA using gel Electrophoresis
3. Transfer of RNA to a membrane
4. Hybridization and Washing
5. Visualization

با توجه به شکل بالا:

مرحله اول RNA isolation جهت جداسازی RNA می باشد که میتوان با روش فنل کلروفرم گوانیدیوم تیوسیانات یا با استفاده از کیت های ستونی حاوی فیلتر، عمل جداسازی را انجام داد.

مرحله ی بعدی الکتروفورز است که قطعات RNA براساس اندازه از یکدیگر جدا می شوند. مرحله ی سوم، مرحله انتقال از روی ژل بر روی غشا(عمل بلاتینگ) می باشد.

در مرحله چهار عمل هیبریداسیون انجام می شود و مرحله ی نهایی شست و شو و سپس توسط فیلم اشعه X عمل مشاهده صورت خواهد گرفت.

نکته مهم:

RNA می تواند یکسری ساختارهای ثانویه یا Secondary structure را تشکیل دهد که باید به کمک یکسری عوامل، از ایجاد این ساختارها جلوگیری کرد، به عنوان مثال میتوان از فرمالدهید استفاده نمود زیرا نیازمند RNA تک رشته ای می باشیم.

• مرحله انتقال RNA از روی ژل بر روی غشا(Blotting) با خاصیت مویینگی صورت می پذیرد. البته میتوان از Vacume transfer که در شرایط خاصی در داخل کیسه وکیوم ترنسفر منتقل می شود نیز بهره برد.(همانند شکل مربوط به DNA در Southern blotting)

شکل زیر نمونه دیگری از عمل Northern Blotting را نشان می دهد:

کاربردهای Northern Blotting:

1. کاربرد اصلی آن در مطالعات RNA است، به عنوان نمونه برای شناسایی mRNA ای که به وسیله ترنسژن که در نهایت به یک پروتئین نوترکیب تبدیل می شود، میتوان از این تکنیک استفاده کرد.
2. mRNA های خاص با وزن های مولکولی متفاوت و محتویات mRNA را میتوان در نمونه بررسی کرد.
3. بررسی تخریب mRNA و RNA degredation
4. جهت نشان دادن افزایش بیان ژن های آنکوژن و کاهش بیان ژن های مهار کننده تومور
5. جهت تشخیص برخی بیماری ها همچون بیماری کرون، می توان از این تکنیک استفاده کرد.

مزایا و معایب تکنیک Northern Blotting:

• مزایا:

ساده و مقرون به صرفه است البته به شرطی که بخواهیم یک ژن را بررسی کنیم، ولی اگر قصد آنالیز در مقیاس وسیع انجام بدهیم باید RNA های خیلی زیادی را استخراج و بررسی کنیم و به میزانی که واکنش ها بیشتر باشد، هزینه بالاتر خواهد رفت.

می توانیم مجددا از غشا استفاده کنیم.

به دلیل حساسیت این روش می توانیم تغییرات بیان ژن را مورد مطالعه قرار بدهیم.

• معایب:

ما در یک زمان فقط می توانیم یک ژن را بررسی کنیم پس از نظر زمان مقرون به صرفه نیست.

اگر بخواهیم این تکنیک را برای RNA های زیادی به کار ببریم، هزینه ی آن بالا می رود.