ساترن بلات(Southern Blotting):
نویسنده:خانم فاطمه رکاب
دانشجوی ارشد نانوبیوتکنولوژی دانشگاه اراک
اگر به دنبال انتقال DNA بر روی غشا باشیم، از تکنیک ساترن بلات استفاده خواهیم کرد.
آقای Southern که یک زیست شناس مولکولی بودند، این تکنیک را در سال 1975 پایه گذاری نموده و به افتخار ایشان این تکنیک را Southern Blotting نام گذاری کردند.
اساس این روش بدین صورت است که قطعات جدا شده DNA را پس از انجام الکتروفورز، بر روی یک غشا که معمولا نیتروسلولزی هست، منتقل نموده و سپس قطعات مدنظر(DNA target) را از طریق عمل هیبریداسیون(Hybridisation) که با استفاده از یکسری پروب اختصاصی صورت می گیرد، شناسایی می کنیم.
پروب ها به صورت مصنوعی و در شرایط آزمایشگاهی بدین صورت که مواد رادیو اکتیو با فلورسنت نشاندار می شوند، به دست می آیند.
هیبریداسیون به عمل جفت شدن یا هیبرید شدن یا اتصال DNA هدف تک رشته ای با پروب تک رشته ای می گویند که به جداسازی و شناسایی قطعات کمک می کند.
مراحل Southern Blotting:
- ابتدا باید DNA هدف را از سلول های مورد مطالعه، خالص و جداسازی کنیم.
- Fragmentation: به کمک آنزیم های اندونوکلئاز(محدود کننده)، DNA را به قطعات کوچک تر می شکنیم.
- Electrophoresis: قطعات DNA را به کمک الکتروفورز ژل آگارز جداسازی نموده که در این حالت قطعات DNA دارای بار منفی به سمت قطب مثبت حرکت کرده و براساس اندازه شان جداسازی می شوند.
- Depurination: این مرحله انتخابی بوده و قبل از انتقال بر روی غشا انجام می گردد، طی این مرحله بازهای پورین را بر می دارند و زمانی از این مرحله استفاده می کنیم که قطعات DNA طویل تر از 15 kb باشند. از HCL میتوان جهت ایجاد شکست های مد نظر برای افزایش اثر انتقال قطعات، بر روی رشته DNA استفاده کرد.
در شکل زیر می توانید عمل دپورینیشن را مشاهده نمایید.
در این تصویر فرایند Depurination را مشاهده می کنید که در طی آن بازهای آدنین و گوانین که پورین می باشند، از ترکیب جدا شده و یک قند فاقد پورین ایجاد می شود. طبق گفته های قبل میتوان از HCL جهت ایجاد nick یا شکست استفاده نمود.
- Denaturation: در این مرحله از ترکیبات قلیایی همانند NaOH (سدیم هیدروکسید)، میتوان جهت شکستنDNA دو رشته ای به DNA تک رشته ای بهره برد. این تک رشته ای شدن DNA زمینه ساز خوبی جهت جفت شدن با پروب(عمل Hybridisation) می باشد. ممکن است در این مرحله رشته DNA در برخی نقاط با خودش هیبرید شود که برای جلوگیری از این عمل از NaCl جهت خنثی سازی این واکنش استفاده می گردد.
- Blotting: طی این مرحله قطعات دناتوره شده را به غشا نیتروسلولزی یا نایلونی منتقل می کنیم.
مرحله انتقال از الکتروفورز بر روی غشا، به روش های مختلفی انجام می گیرد:
- براساس خاصیت مویینگی(Capilary blotting)
- براساس خاصیت جریان الکتریسیته(Electro blotting)
- به واسطه خلا(Vacume blotting)
- به واسطه فشار مثبت(Positive pressure blotting)
هر کدام از روش های انتقال ذکر شده در بالا دارای توضیحات مفصلی است که در اینجا چشم پوشی شده است.
نکته: اگر صافی از نوع نیتروسلولزی باشد، انتقال باید در pH خنثی انجام شود. اما اگر از نوع نایلونی باشد، باید در pH خنثی یا قلیایی انجام بگیرد.
- Baking: یعنی حرارت دادن با گرمای خشک جهت تثبیت DNA بر روی غشا نیتروسلولزی و همچنین از پرتو UV نیز برای تثبیت DNA بر روی غشای نایلونی استفاده می گردد.
- Hybridisation: در این مرحله از پروب های نشاندار شده تک رشته ای جهت اتصال به قطعات DNA تک رشته ای استفاده می کنیم و پروب براساس رادیو اکتیویته ای که از خود نشان می دهد، به شناسایی کمک می کند.
نکته: Label دار یا نشاندار کردن فقط از طریق رادیو ایزوتوپ صورت نمی گیرد بلکه میتوان از مولکول های فلورسنت یا رنگ های کروموژنیک نیز استفاده کرد.
- Washing: در این مرحله پروب هایی که به قطعات DNA هدف متصل نشده اند، شناسایی می گردد. گاهی پروب ها یا متصل نمی شوند و یا به صورت غیر اختصاصی متصل می شوند و چون اتصال محکمی ندارند، با شست و شو به راحتی از سطح غشا جدا شده و فقط توالی های خاص باقی خواهند ماند.
- اتورادیوگرافی: این مرحله زمانی به کار می رود که از Label های رادیو ایزوتوپ برای نشان دار کردن پروب استفاده کرده باشیم. طی آن نواحی هیبرید شده از طریق قرار دادن غشای نیتروسلولزی در تماس با فیلم فتوگرافی میتوانیم آشکارسازی انجام داده و الگوی هیبرید شده را با استفاده از اشعه X آشکار کنیم.
در تصویر مشاهده می کنید که پس از انجام الکتروفورز DNA بر روی ژل آگارز، قطعات جدا شده از روی ژل بر روی غشا منتقل می شوند، در مرحله بعدی عمل هیبرید شدن در داخل یک کیسه مهر و موم شده با پروب های نوکلئیک اسیدی که با P53 نشاندار شده اند، انجام می گیرد.(پروب ها قرمز رنگ و شبیه کرم می باشند و مکمل DNA های تک رشته ای هستند.) بعد از انجام مرحله شست و شو، آن را در معرض اشعه X قرار داده و در نهایت اتورادیوگرام خروجی از اتورادیوگرافی را مشاهده می کنید.
کاربردهای تکنیک Southern Blotting:
DNA fingerprinting که در کارهای جنایی از این تکنیک استفاده می شود.
برای شناسایی یک قطعه خاص از DNA هدف در Sample
جهت شناسایی موتاسیون ها(جهش) و بازآرایی هایی که در DNA رخ داده است.
برای شناسایی ترنسژن در مدل ترنسژنیک
در نقشه برداری نواحی و سایت های برشی
جهت تشخیص یکسری بیماری ها همچون سرطان و تشخیص بیماری های ژنتیکی قبل از تولد
برای مطالعه دیگر تکنیک های بلاتینگ در ادامه و فایل های بعدی با ما همراه باشید.
