نویسنده:خانم فاطمه رکاب
دانشجوی ارشد نانوبیوتکنولوژی دانشگاه اراک
برای دانلود فایل این وبلاگ به کانال تلگرام مراجعه کنید.
تعریف الایزا:
الایزا یا Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)، یک روش بیوشیمیایی رایج جهت بررسی برهمکنش میان آنتی ژن و آنتی بادی و به طور کلی برای اندازه گیری میزان غلظت آنتی ژن ها یا آنتی بادی ها در خون می باشد.
این تکنیک بر روی یک صفحه(Plate) چند خانه ای(تعداد خانه های می تواند متغیر باشد) از جنس پلی استایرن جهت اندازه گیری پپتیدها، آنتی بادی ها و هورمون ها انجام می گیرد.
از یک آنزیم به عنوان نشانگر جهت اتصال به آنتی بادی برای تولید یک محصول رنگی با مصرف سوبسترا استفاده می شود که از آنزیم ها به عنوان مثال میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
- آلکالین فسفاتاز
- اسیدرادیک پراکسیداز
- بتاگالاکتوزیداز
ترکیبات مختلفی به عنوان سوبسترا در این تکنیک به کار برده می شوند که توسط آنزیم ها هیدرولیز گردیده و در نهایت محصول رنگی تولید می شود که به ما در تشخیص کمک می کند.
اصول الایزا:
سرم ها(Samples) در چاهک های Plate مدنظر که برای هر تستی متفاوت از دیگری بوده و دارای انواع گوناگونی می باشد، کوت شده و هر چاهک حاوی سرم متفاوتی خواهد بود.
چاهک اول و دوم برای کنترل های مثبت و منفی و به ترتیب از چاهک سوم به بعد مربوط به نمونه های سرمی می باشد که به ترتیب کوت خواهند شد.
دلیل بارگذاری کنترل مثبت و منفی:
میزان خطای کارمان که در روند کار ایجاد شده است، مشخص می گردد.
در هر چاهک، آنتی بادی به آنتی ژن مورد نظر متصل و به طور کلی آنتی بادی ها یا آنتی ژن های موجود در هر سرم، به آنتی ژن ها یا آنتی بادی های مشابه موجود، اتصال می یابند.
بعد از گذشت زمان تعیین شده که برای هر تست یا کیت متفاوت از دیگریست، طبق دستورالعمل موجود، آنتی بادی ها یا آنتی ژن های متصل نشده با بافر های شست و شو حذف می گردند.
برای شناسایی آنتی بادی ها یا آنتی ژن های متصل شده، آنتی بادی های ثانویه ای که حامل یک آنزیم نشاندار می باشند، به هر چاهک اضافه شده و پس از یک دوره انکوباسیون، آنتی بادی های ثانویه ای که به آنتی ژن متصل نشده اند، توسط عمل شست و شو با بافرهای مخصوص به خود که با آب مقطر رقیق شده اند، حذف می شوند.
زمانی که یک سوبسترای مناسب به محیط چاهک اضافه شود، آنزیم ها با آن واکنش داده و پس از هیدولیز آن توسط آنزیم ها، یک محصول رنگی قابل ردیابی و تشخیص تولید خواهد شد.
این رنگ تولید شده به عنوان یک تابع از مقدار آنتی ژن یا آنتی بادی موجود در نمونه توسط دستگاه ELISA reader قابل اندازه گیری(کمی) می باشد.
انواع الایزا:
1)الایزای مستقیم(Direct ELISA):
در این روش به طور خلاصه سطح پلیت به طور مستقیم با آنتی ژن پوشش داده می شود.
آنتی بادی اولیه نشاندار شده با آنزیم میتواند به آنتی ژن مورد نظر متصل و میزان غلظت آن را در نهایت اندازه گیری کرد.
پس از انکوباسیون، آنتی بادی های آزاد و متصل نشده به آنتی ژن با عمل شست و شو حذف می گردند و سپس سوبسترای مناسب آنزیم، به محیط چاهک اضافه شده و یک سیگنال رنگی تولید می کند که به طور مستقیم با مقدار آنتی ژن موجود در نمونه در ارتباط می باشد.
الایزا بدین روش، جهت تعیین آنتی ژن هایی که دارای وزن مولکولی بالایی هستند مناسب بوده و به عنوان ساده ترین و سریع ترین آزمون الایزا، به شمار می رود.
اما از معایب این روش میتوان گفت، به دلیل اینکه نشاندار کردن آنتی بادی های اولیه فرایندی زمان بر و پر هزینه است و از سوی دیگر ممکن است این روش برهمکنش آنتی بادی با آنتی ژن هدف را تحت تاثیر قرار دهد، از این رو به ندرت استفاده می شود.
2)الایزای غیر مستقیم(Indirect ELISA):
در این روش ابتدا آنتی ژن را بر روی سطح چاهک کوت می کنند، سپس سرم حاوی آنتی بادی اولیه را به چاهک ها اضافه نموده و اجازه می دهند با آنتی ژن اتصال برقرار کند.
سپس هر یک از آنتی بادی های متصل نشده، با شست و شو از بین رفته و آنتی بادی متصل به آنتی ژن، با افزودن ثانویه نشاندار شده با آنزیم، تشخیص داده می شوند. بدین صورت که، بعد حذف آنتی بادی های ثانویه اتصال نیافته و اضافه نمودن سوبسترا به محیط، آنزیم، سوبسترا را برای ایجاد محصولات رنگی هیدرولیز می کند.
مقدار محصول رنگی نهایی توسط دستگاه ELISA reader مورد خوانش و اندازه گیری قرار می گیرد.
این روش معمولا جهت تشخیص عفونت ایجاد شده توسط باکتری، ویروس و انگل و همچنین اندازه گیری آنتی بادی ها علیه آنتی ژن خارجی استفاده می شود.
الایزای غیر مستقیم روشی بسیار حساس تر و انعطاف پذیرتر از الایزای مستقیم محسوب می گردد، چرا که هر آنتی بادی اولیه شامل چندین اپی توپ می باشد که میتواند به آنتی بادی ثانویه نشاندار متصل شده و بدین ترتیب سیگنال ایجاد شده را تقویت کند.
3)الایزا ساندویچ(Sandwich ELISA):
در این تکنیک، آنتی بادی ها سطح چاهک ها را پوشش می دهند. سپس نمونه حاوی آنتی ژن به چاهک ها
اضافه شده و بعد از آن برای انجام واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی زمان داده می شود.
پس از انجام مراحل شست و شو، آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم، به واکنش اضافه شده و اجازه داده می شود تا این آنتی بادی به آنتی ژن اتصال یابد.
پس از این مرحله، آنتی بادی های آزاد با شست و شو حذف می شوند و در نهایت سوبسترا اضافه می گردد که توسط آنزیم هیدرولیز شده و محصولات رنگی تولید می کند.
این روش از این روز ساندویچ خوانده میشود که یک آنتی ژن بین دو آنتی بادی قرار میگیرد و ساختاری شبیه به ساندویج ایجاد می کند.
4)الایزای رقابتی(Competitive ELISA):
در این نوع الایزا، آنتی بادی ضد آنتی ژن مد نظرمان را در ته چاهک کوت می کنیم. سپس نمونه را به چاهک ها اضافه نموده و اجازه میدهیم آنتی ژن موجود در سرم به آنتی بادی متصل شود، اما باید توجه داشت که غلظت آنتی ژن اضافه گردیده آنقدر زیاد نیست که بتواند به تمام آنتی بادی ها متصل شود.
در قدم بعدی، آنتی ژن هدف را که به آنزیم نشاندار متصل می باشد، به چاهک ها اضافه می نماییم تا با آنتی بادی های ته چاهک اتصال برقرار کند.
سپس سوبسترا را اضافه می کنیم. شدت رنگ حاصل، بیانگر میزان شدت غلظت ماده ی مورد نظرمان خواهد بود.
در اصل در این نوع تکنیک، بین آنتی ژن بدون آنزیم و آنتی ژن کونژوگه شده با آنزیم رقابت وجود دارد.
روش رقابتی خود به دو روش:
1)رقابتی برای آنتی بادی:
رقابت میان دو آنتی بادی است که یکی از آنها در نمونه قرار گرفته و بدون آنزیم نشان دار است و دیگری آنتی بادی نشان دار شده با آنزیم است که برای اتصال به یک آنتی ژن اتصال یافته به سطح چاهک ها با هم به رقابت می پردازند.
2)مهاری برای آنتی ژن:
بررسی رقابت بین آنتی ژن نشان دار شده و آنتی ژن موجود در نمونه برای اتصال به یک آنتی بادی اختصاصی است.
کاربرد های الایزا:
- بررسی وجود آنتی ژن یا حضور آنتی بادی در نمونه
- تعیین غلظت آنتی بادی سرم در یک آزمایش ویروسی
- شناسایی آلرژن ها و پاتوژن ها در صنایع غذایی
- در آزمایشگاه های پزشکی، ردیابی بیماری هایی همچون:HIV، آنفولانزا، سرما خوردگی، وبا، کرونا و...
تفسیر داده های الایزا:
داده های الایزا به طور معمول به صورت نمودارهایی از چگالی نوری(یا فلورسانس) در مقابل غلظت تهیه می شود تا یک منحنی سیگموئیدی ایجاد گردد.
