وسترن بلات

Western blotting یا تکنیک پروتئین ایمنوبلاتینگ، روشی است که می توان به کمک آن پروتئین های مدنظرمان را در یک نمونه، عصاره یا هموژنات بافتی تشخیص داده و بررسی کنیم.  این تکنیک در سال 1979 ارائه گریده و به عنوان روشی مهم در زمینه آنالیز پروتئین ها عمل می کند چرا که از یک آنتی بادی(Ab) به صورت اختصاصی جهت شناسایی آنتی ژن(Ag) استفاده می کنیم.

Principle of Western blotting

The technique consists of three major processes:

1. Separation of protein by size (Electrophoresis)
2. Transfer to a solid support (Blotting)
3. Making target protein using a proper primary and secondary Ab to visualize

(Detection)

وسترن بلات به طور کلی شامل 3 مرحله می باشد:

1. جداسازی پروتئین ها براساس اندازه (الکتروفورز)
2. انتقال از روی ژل بر روی غشا (بلاتینگ) که غشا می تواند از جنش نیتروسلولز همانند PVDF باشد.
3. انجام عمل بلاکینگ جهت جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی Ab بر روی سطح غشا(Ag)
4. انجام عمل هیبریداسیون با اتصال Ab نشان دار شده با آنزیم
5. شست و شو
6. تشخیص (Detection)
7. تجزیه و تحلیل نتایج حاصل گردیده

اطلاعاتی که از وسترن بلات به دست می آوریم، کیفی است یعنی پس از استخراج پروتئین مدنظر می توانیم باند حاصل از آن را به صورت کیفی و چشمی ببینیم. بنابراین نمی توان به صورت دقیق میزان بیان ژن را تخمین زد اما می توان از روی ضخامت باند ایجاد شده، نتیجه گیری کرد که میزان بیان پروتئین کم یا زیاد شده است.

روش هایی که برای شناسایی یا Detection در وسترن بلات استفاده می شوند، شامل:

1. روش مستقیم(Direct)
2. روش غیر مستقیم(Indirect)

در روش مستقیم:

از یک آنتی بادی اولیه که با رنگ فلورسنت یا یک آنزیم همراه(کونژوگه) نشان دار شده است، جهت اتصال به آنتی ژن هدف استفاده می کنند.

در شکل زیر مشاهده می کنید که آنتی بادی نشان دار شده با آنزیم که به شکل Y بوده، به یک مولکول هدف یا Ag متصل گردیده است.

باید توجه داشت که آنزیم ها برای عملکرد خود به سوبسترا نیاز دارند، زمانی که سوبسترای مورد نیاز آنزیم را فراهم می کنیم، آنزیم یک محصول رنگی برای ما تولید می کند که از این طریق می توانیم پروتئین مورد نظر را شناسایی کنیم.

مزیت های روش مستقیم:

• یک روش سریع و تک مرحله ای( بعد از انجام عمل بلاتینگ، Ab را اضافه می کنیم تا به Ag مدنظرمان متصل گردد.)
• عدم ایجاد واکنش های متقاطع در اثر استفاده از آنتی بادی های ثانویه

معایب روش مستقیم:

• ممکن است قدرت اتصال Ab اولیه به Ag کاهش یابد.
• احتمال کاهش میزان سیگنال دریافتی

در روش غیر مستقیم:

در این روش یک Ab ثانویه نشان دار شده(با آنزیم) به Ab اولیه متصل می گردد. بنابراین می توان گفت Ab اولیه علیه Ag و Ab ثانویه علیه Ab اولیه عمل خواهد کرد.

لیبل های مورد نظر که جهت اتصال و نشان دار کردن، به Ab ثانویه متصل می شوند، می توانند شامل: بیوتین، پروب های فلورسنت همانند فلورسین و رودامین یا آنزیم HRP (Horse radish proxidase) و دیگری آلکالین فسفاتاز باشد.

 به تصویر زیر دقت کنید:

با توجه به تصویر بالا، آنتی بادی که به صورت Y برعکس بوده و سیاه رنگ است، آنتی بادی اولیه متصل به Ag بوده و Y های قرمز رنگ، آنتی بادی های ثانویه نشان دار شده با آنزیم می باشند که با اضافه نمودن سوبسترا و مصرف آن محصول رنگی تولید می کنند.

مزیت های روش غیر مستقیم(Indirect):

• آنتی بادی ثانویه سیگنال را به خوبی تقویت نموده و باند خیلی خوبی را ایجاد می کند.
• یک آنتی بادی ثانویه را می توان با انواع آنتی بادی های اولیه استفاده نمود.

معایب روش غیر مستقیم:

• ممکن است آنزیم مدنظر به صورت غیراختصاصی به مولکولی به جز Ab هدف متصل شود.
• یک روش دو مرحله ای است که احتمال بروز اشتباه افزایش می یابد.

تفاوت تکنیک الایزا با وسترن بلات:

اساس هر دو روش یکی است و جهت تشخیص و شناسایی پروتئینی خاص در نمونه به کار می روند، اما به طور کلی الایزا دارای حساسیت بیشتری نسبت به تکنیک وسترن بلات می باشد.