Gram Stain:
تکنیک رنگ آمیزی گرم Gram stain یا Gram staining، که به آن روش Gram نیز گفته می شود، روشی است که برای تشخیص و طبقه بندی گونه های باکتریایی به دو گروه بزرگ (گرم مثبت و گرم منفی) استفاده می گردد. نام این تکنیک از باکتری شناس دانمارکی به نام هانس کریستین گرام آمده است که توسعه دهنده ی این روش بوده است.
رنگ آمیزی گرم، باکتری ها را به کمک خواص شیمیایی و فیزیکی دیواره سلولی آنها متمایز می کند.
سلولهای گرم مثبت دارای یک لایه ضخیم از پپتیدوگلیکان در دیواره سلولی خود هستند که رنگ اصلی، کریستال بنفش را حفظ می کنند در حالی که سلولهای گرم منفی دارای یک لایه پپتیدوگلیکان نازک تر می باشند که حین عمل شست و شو علاوه بر اتانول، کریستال بنفش نیز حذف می شود.
رنگ آمیزی گرم یک روش آزمایشگاهی باکتریولوژیکی است که برای تمایز گونه های باکتریایی به دو گروه بزرگ (گرم مثبت و گرم منفی) بر اساس خصوصیات دیواره سلولی آنها استفاده می گردد.
از رنگ آميزي گرم براي طبقه بندي آرکی ها استفاده نمي شود، زيرا اين ميكروارگانيسم ها به طور گسترده پاسخ هاي متفاوتي را ارائه مي دهند كه از گروه هاي فيلوژنتيك خودشان تبعيت نمي كنند.
باید توجه داشت که رنگ آمیزی Gram ابزاری دقیقی جهت تشخیص و شناسایی نبوده و در میکروبیولوژی محیطی دارای کاربرد بسیار محدودی است.
این روش عمدتاً جهت شناسایی اولیه مورفولوژیک یا برای تعیین وجود تعداد قابل توجهی از باکتری ها در یک نمونه بالینی مورد استفاده قرار می گیرد. این تکنیک نمی تواند باکتری ها را در سطح گونه تشخیص دهد و در بیشتر موارد پزشکی نباید از آن به عنوان تنها روش شناسایی باکتری ها استفاده نمود.
امروزه در آزمایشگاه های میکروبیولوژی بالینی، این تکنیک را در ترکیب با سایر تکنیک های سنتی و مولکولی جهت شناسایی باکتری ها استفاده می کنند. برخی از ارگانیسم ها متغیرهای گرم هستند (به این معنی که ممکن است رنگ منفی یا مثبتی داشته باشند)، برخی از آنها نیز با هیچ کدام از دو رنگ استفاده شده در روش گرم، رنگ آمیزی نشده و دیده نمی شوند.
در یک آزمایشگاه میکروبیولوژی مدرن محیطی یا مولکولی، بیشترین شناسایی با استفاده از توالی ژنتیکی و سایر تکنیک های مولکولی انجام می گردد، که به مراتب اختصاصی تر از رنگ آمیزی های تمایزی عمل می کنند.
مراحل رنگ آمیزی گرم به شرح زیر می باشد:
- تثبیت مواد بالینی:
تثبیت نمونه بر روی سطح(لام) به کمک روش گرم کردن یا ریختن متانول بر روی سطح مدنظر حاوی نمونه مورد نظر
تثبیت به کمک متانول مورفولوژی سلول های میزبان و همچنین باکتری ها را حفظ نموده و به ویژه جهت بررسی نمونه های خونی مفید می باشد.
- استفاده از رنگ اصلی(crystal violet):
تمامی سلول ها به رنگ آبی و بنفش در می آیند.
- استفاده از ماده ثابت کننده:
محلول ید به عنوان ماده ثابت کننده اضافه می شود تا یک ترکیب با کریستال بنفش شکل گیرد. تمامی سلول ها به رنگ آبی ظاهر می شوند.
- حذف رنگ:
طی این مرحله، باکتری های گرم منفی و مثبت از هم جدا می شوند. حلال های ارگانیک مانند: استون و اتانول، مجموعه رنگ های آبی را از باکتری های گرم منفی که حاوی لیپید و دیواره های نازک هستند تا درجات بیشتری نسبت به باکتری های گرم مثبت، می شویند. به این ترتیب باکتری های گرم منفی کم رنگ تر دیده می شوند.
- استفاده از رنگ های تمایزی همانند Safranin:
رنگ سافرانین، رنگ سلول های گرم منفی را به قرمز/ صورتی تبدیل می کند. در حالی که باکتری های گرم مثبت آبی رنگ باقی می مانند.
تمامی مراحل را می توانید در شکل زیر مشاهده بفرمایید:
نتایج:
- باکتری های گرم منفی صورتی/ قرمز رنگ می شوند.
- باکتری های گرم مثبت به رنگ آبی و بنفش در می آیند.
از رنگ آمیزی گرم به دو جهت استفاده می شود:
- شناسایی جنس باکتری
- انتخاب آنتی بیوتیک مناسب( باکتری های گرم مثبت در مقایسه با باکتری های گرم منفی، نسبت به پنی سیلین G ،که آنتی بیوتیکی است که در برابر طیف گسترده ای از عفونت های باکتریایی موثر می باشد، حساسیت بیشتری دارند.)
برای مطالعه بیشتر می توانید از مقاله زیر استفاده نمایید..
منبع:
Differential Staining of Bacteria: Gram Stain
Rita B. Moyes, Jackie Reynolds, and Donald P. Breakwell
