الودگی‌های رایج در کشت سلولی به عنوان یک موضوع مهم و چالش‌برانگیز در علم سلولی و مولکولی مطرح می‌شوند. در زیر چند الودگی رایج در کشت سلولی ذکر شده‌اند:
- فنلهای متابولیتیک: الودگی‌هایی مانند لاکتات، آمونیاک، اسید لاکتیک و اسید پیروویک ممکن است در فرآیند کشت سلولی ایجاد شوند که می‌توانند به رشد و عملکرد سلول‌ها آسیب برسانند.
- پروتئین‌های خارجی: پروتئین‌های غیرمنظم و ناخالصی ممکن است در محیط کشت حاضر شده و به سلول‌ها الوده شوند. این مواد می‌توانند تأثیر منفی بر عملکرد سلولی داشته باشند.
- فاکتورهای رشد ناپایدار: فاکتورهای رشد ممکن است در طی فرآیند کشت تجزیه شده و غیرفعال شوند، که این امر به رشد و عملکرد سلول‌ها آسیب می‌زند.
- میکروب‌ها و قارچ‌ها: آلودگی با باکتری‌ها، قارچ‌ها یا ویروس‌ها ممکن است در کشت‌های سلولی رخ دهد که می‌تواند به سلول‌ها آسیب برساند و کیفیت تولیدات را کاهش دهد.
- روغن‌ها و لیپیدها: روغن‌ها و لیپیدهای الوده به محیط کشت، ممکن است تأثیر منفی بر روی محیط رشد سلولی و خواص محصول نهایی داشته باشند.
- آلاینده‌های اختلال‌آور: مواد شیمیایی، آلاینده‌های محیطی و مواد اختلال‌آور ممکن است در محیط کشت وارد شوند و به سلول‌ها آسیب برسانند.
برای جلوگیری از الودگی‌ها در کشت سلولی، می‌توانید از راهکارهای مختلفی استفاده کنید. در زیر، تعدادی از راهکارهای جلوگیری از الودگی در کشت سلولی آورده شده‌اند:
1. استفاده از محیط کشت مناسب:
انتخاب محیط کشت مناسب با توجه به نوع سلول و خواص مورد نظر، می‌تواند کمک کند تا الودگی‌ها کاهش یابند.
2. پاکسازی و استریلیزاسیون:
استفاده از فرآیندهای پاکسازی و استریلیزاسیون مناسب برای تجهیزات، محیط کشت، و مواد مورد استفاده، می‌تواند از ورود میکروب‌ها و ذرات ناخالصی به کشت سلولی جلوگیری کند.
3. کنترل محیط:
کنترل متغیرهای محیطی مانند دما، رطوبت، و میزان اکسیژن و دی اکسید کربن، می‌تواند به بهبود شرایط کشت و جلوگیری از الودگی‌ها کمک کند.
4. استفاده از سیستم‌های بسته:
استفاده از سیستم‌های بسته و اجتناب از تماس مستقیم با محیط خارجی می‌تواند احتمال الودگی‌ها را کاهش دهد.
5. مانیتورینگ مستمر:
مانیتورینگ و کنترل مستمر بر روی شرایط کشت، باعث تشخیص سریع مشکلات و جلوگیری از گسترش الودگی‌ها می‌شود.
6. استفاده از مواد ضدمیکروبی:
اضافه کردن مواد ضدمیکروبی به محیط کشت یا مصرف مواد ضدعفونی کننده می‌تواند از رشد باکتری‌ها و قارچ‌ها جلوگیری کند.
7. آموزش کارکنان:
اطمینان از آموزش کارکنان در خصوص روش‌های استریلیزاسیون، پاکسازی و مراقبت از محیط کشت، می‌تواند نقش مهمی در جلوگیری از الودگی‌ها ایفا کند.
8. توسعه فرآیندهای بهینه:
بهبود و بهینه‌سازی فرآیندهای کشت سلولی به منظور کاهش زمان و احتمال الودگی‌ها می‌تواند کمک کند.
با اجرای این راهکارها، می‌توانید محیط کشت سلولی را از الودگی‌ها حفاظت کرده و به بهبود عملکرد سلول‌ها و کیفیت محصول نهایی بپردازید.
آلودگی کشت‌های سلولی به راحتی شایع‌ترین مشکلی است که در آزمایشگاههای کشت سلولی با آن مواجه می‌شود و گاهی اوقات عواقب بسیار جدی را به همراه دارد. آلاینده های کشت سلولی را می توان به دو دسته اصلی، آلاینده های شیمیایی مانند ناخالصی های موجود در محیط، سرم و آب، اندوتوکسین ها، نرم کننده ها و مواد شوینده و آلاینده های بیولوژیکی مانند باکتری ها، کپک ها، مخمرها، ویروس ها، مایکوپلاسما و همچنین متقاطع تقسیم کرد. آلودگی توسط رده های سلولی دیگر در حالی که حذف کامل آلودگی غیرممکن است، می توان با به دست آوردن درک کامل از منابع آنها و با پیروی از تکنیک خوب آسپتیک، فراوانی و جدیت آن را کاهش داد.
در این بخش مروری بر انواع عمده آلودگی بیولوژیکی ارائه می شود:
آلودگی باکتریایی
آلودگی قارچی و ویروسی
آلودگی مایکوپلاسما
آلودگی مخمر
آلودگی متقابل
در حالی که به اندازه آلودگی میکروبی رایج نیست، آلودگی متقاطع گسترده بسیاری از رده های سلولی با HeLa و سایر رده های سلولی در حال رشد سریع یک مشکل آشکار با عواقب جدی است. دریافت خطوط سلولی از بانک‌های سلولی معتبر، بررسی دوره‌ای ویژگی‌های خطوط سلولی و انجام تکنیک‌های خوب آسپتیک، اقداماتی هستند که به شما در جلوگیری از آلودگی متقابل کمک می‌کنند. انگشت نگاری DNA، تجزیه و تحلیل کاریوتایپ و آنالیز ایزوتیپ می تواند وجود یا عدم وجود آلودگی متقاطع را در کشت های سلولی شما تایید کند.
استفاده از آنتی بیوتیک
آنتی بیوتیک ها نباید به طور معمول در کشت سلولی استفاده شوند، زیرا استفاده مداوم از آنها باعث ایجاد سویه های مقاوم به آنتی بیوتیک می شود و اجازه می دهد تا آلودگی سطح پایین باقی بماند، که می تواند پس از حذف آنتی بیوتیک از محیط، به آلودگی در مقیاس کامل تبدیل شود و ممکن است مایکوپلاسما را پنهان کند. عفونت ها و سایر آلاینده های مرموز. علاوه بر این، برخی از آنتی بیوتیک ها ممکن است با سلول ها واکنش متقابل داشته باشند و در فرآیندهای سلولی مورد بررسی تداخل ایجاد کنند.
آنتی بیوتیک ها فقط باید به عنوان آخرین راه حل و فقط برای کاربردهای کوتاه مدت استفاده شوند و باید در اسرع وقت از کشت حذف شوند. اگر آنها در طولانی مدت استفاده شوند، کشت های عاری از آنتی بیوتیک باید به طور موازی به عنوان کنترل عفونت های مرموز نگهداری شوند.
باکتری ها گروه بزرگ و همه جا از میکروارگانیسم های تک سلولی هستند. آنها معمولاً چند میکرومتر قطر دارند و می توانند اشکال مختلفی داشته باشند، از کره گرفته تا میله و مارپیچ. به دلیل وجود همه جا، اندازه و سرعت رشد سریع، باکتری ها، همراه با مخمرها و کپک ها، رایج ترین آلاینده های بیولوژیکی هستند که در کشت سلولی با آن مواجه می شوند.
تشخیص آلودگی باکتریایی
آلودگی باکتریایی به راحتی با بازرسی بصری کشت ظرف چند روز پس از آلوده شدن آن شناسایی می شود.
کشت های آلوده معمولاً کدر به نظر می رسند (یعنی کدر)، گاهی اوقات با یک لایه نازک روی سطح.
افت ناگهانی در pH محیط کشت نیز اغلب مشاهده می شود.
در یک میکروسکوپ کم قدرت، باکتری ها به صورت دانه های ریز و متحرک بین سلول ها ظاهر می شوند و مشاهده زیر یک میکروسکوپ با قدرت بالا می تواند اشکال تک تک باکتری ها را مشخص کند.
تصاویر شبیه سازی شده زیر کشت سلولی چسبنده 293 آلوده به E. coli را نشان می دهد.
شکل 1: تصاویر کنتراست فاز شبیه سازی شده از 293 سلول چسبنده آلوده به E. coli. فضاهای بین سلول های چسبنده گرانول های ریز و درخشان را در زیر میکروسکوپ کم توان نشان می دهند، اما تک تک باکتری ها به راحتی قابل تشخیص نیستند (پانل A). بزرگنمایی بیشتر ناحیه محصور شده توسط مربع سیاه، سلول های E. coli را که معمولاً میله ای شکل هستند و حدود 2 میکرومتر طول و 0.5 میکرومتر قطر دارند، جدا می کند. هر ضلع مربع سیاه در پانل A 100 میکرومتر است
آلودگی کپک
کپک ها میکروارگانیسم های یوکاریوتی در قلمرو قارچ ها هستند که به صورت رشته های چند سلولی به نام هایف رشد می کنند. یک شبکه متصل از این رشته های چند سلولی حاوی هسته های ژنتیکی یکسان است و به آنها کلنی یا میسلیوم می گویند.
تصویر2:آلودگی با کپک
مشابه آلودگی مخمری، pH کشت در مراحل اولیه آلودگی ثابت می ماند، سپس با آلودگی شدیدتر و کدر شدن کشت، به سرعت افزایش می یابد. در زیر میکروسکوپ، میسلیوم‌ها معمولاً به‌صورت رشته‌های نازک و پف‌مانند و گاهی به صورت توده‌های متراکم‌تر از هاگ ظاهر می‌شوند. هاگ های بسیاری از گونه های کپک می توانند در محیط های بسیار خشن و نامناسب در مرحله خواب خود زنده بمانند، فقط در صورت مواجهه با شرایط رشد مناسب فعال می شوند.
آلودگی ویروسی
ویروس ها عوامل عفونی میکروسکوپی هستند که ماشین آلات سلول های میزبان را برای تولید مثل در اختیار می گیرند. اندازه بسیار کوچک آنها تشخیص آنها را در کشت و حذف آنها از معرفهای مورد استفاده در آزمایشگاههای کشت سلولی بسیار دشوار می کند. از آنجایی که بیشتر ویروس‌ها نیازمندی‌های بسیار سخت‌گیرانه‌ای برای میزبان خود دارند، معمولاً روی کشت‌های سلولی گونه‌هایی غیر از میزبان خود تأثیر منفی نمی‌گذارند. با این حال، استفاده از کشت های سلولی آلوده به ویروس می تواند یک خطر جدی برای سلامت پرسنل آزمایشگاه ایجاد کند، به خصوص اگر سلول های انسان یا پستانداران در آزمایشگاه کشت شوند.
عفونت ویروسی کشت های سلولی را می توان با میکروسکوپ الکترونی، رنگ آمیزی ایمنی با پانل آنتی بادی، سنجش ELISA یا PCR با پرایمرهای ویروسی مناسب تشخیص داد.
مایکوپلاسما باکتری های ساده ای هستند که فاقد دیواره سلولی هستند و کوچکترین ارگانیسم خودتکثیر شونده به حساب می آیند. به دلیل اندازه بسیار کوچک آنها (معمولاً کمتر از یک میکرومتر)، تشخیص مایکوپلاسما تا زمانی که به تراکم بسیار بالایی دست یابند و باعث خراب شدن کشت سلولی شود، بسیار دشوار است. تا آن زمان، اغلب هیچ نشانه قابل مشاهده ای از عفونت وجود ندارد.
تشخیص آلودگی مایکوپلاسما
برخی از مایکوپلاسماهای با رشد آهسته ممکن است بدون ایجاد مرگ سلولی در کشت باقی بمانند، اما می توانند رفتار و متابولیسم سلول های میزبان در کشت را تغییر دهند.
عفونت‌های مزمن مایکوپلاسما ممکن است خود را با کاهش سرعت تکثیر سلولی، کاهش چگالی اشباع و آگلوتیناسیون در کشت‌های سوسپانسیون نشان دهند. با این حال، تنها راه مطمئن برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما، آزمایش دوره‌ای کشت‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی فلورسنت (به عنوان مثال، Hoechst 33258)، ELISA، PCR، رنگ‌آمیزی، اتورادیوگرافی، یا سنجش‌های میکروبیولوژیکی است.
شکل 3: فتومیکروگراف های سلول های کشت شده بدون مایکوپلاسما (پانل A) و سلول های آلوده به مایکوپلاسما (پانل های B و C). کشت ها با استفاده از کیت تشخیص مایکوپلاسما MycoFluor™، به دنبال پروتکل های کیت مورد آزمایش قرار گرفتند. در سلول‌های ثابت، معرف MycoFluor™ به هسته‌های سلولی دسترسی دارد که به شدت با معرف رنگ‌آمیزی می‌شوند، اما عدم وجود اجسام خارج هسته‌ای فلورسنت نشان می‌دهد که کشت عاری از آلودگی مایکوپلاسما است (پانل A). در سلول‌های ثابت آلوده به مایکوپلاسما، معرف MycoFluor هم هسته‌ها و هم مایکوپلاسما را رنگ‌آمیزی می‌کند، اما فلورسانس نسبی شدید هسته‌ها، مایکوپلاسما را روی یا نزدیک هسته‌ها پنهان می‌کند. با این حال، مایکوپلاسما جدا شده از هسته های روشن به راحتی قابل مشاهده است (پانل B). در سلول های زنده، معرف MycoFluor™ به هسته ها دسترسی ندارد، اما به راحتی مایکوپلاسما مرتبط با خارج سلول ها (پانل C) را رنگ می کند. تصاویر با استفاده از تحریک 365 نانومتری و یک لنز شیئی 100/1.3 Plan Neoflaur® (Zeiss) همراه با یک فیلتر باند 30 ± 450 نانومتر به دست آمدند.
مخمرها میکروارگانیسم های یوکاریوتی تک سلولی در قلمرو قارچ ها هستند که اندازه آنها از چند میکرومتر (معمولا) تا 40 میکرومتر (به ندرت) متغیر است.
تشخیص آلودگی مخمر
مانند آلودگی باکتریایی، کشت های آلوده به مخمرها کدر می شوند، به خصوص اگر آلودگی در مرحله پیشرفته باشد. تغییر بسیار کمی در pH کشت آلوده به مخمرها تا زمانی که آلودگی سنگین شود، در این مرحله معمولاً pH افزایش می یابد. در زیر میکروسکوپ، مخمر به صورت ذرات بیضی شکل یا کروی ظاهر می شود، که ممکن است ذرات کوچکتر را جوانه بزنند.
تصویر4: شبیه سازی شده زیر کشت سلولی چسبنده 293 را 24 ساعت پس از آبکاری نشان می دهد که آلوده به مخمر است.
